10月7日， 2020年诺贝尔化学奖揭晓，法国生物化学家埃玛纽埃尔·沙尔庞捷（Emmanuelle Charpentier）和美国化学家珍妮弗·杜德纳（Jennifer A. Doudna）摘得奖项，以表彰这两位女科学家发现了基因技术中最犀利的工具之一：CRISPR/Cas9 基因剪刀，使用这一编辑工具，研究人员可以高精度地改变动物、植物和微生物的 DNA，重写生命的密码。

借此机会，我们来聊一聊 CRISPR/Cas9 基因剪刀，并向大家推荐一种方法，检验经由 CRISPR/Cas9 介导的细胞编辑是否能如你所愿。

一、CRISPR/Cas 基因剪刀

CRISPR 是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas 是 CRISPR 相关蛋白的简称，共同组成了一套系统，是细菌用来抵抗病毒和外源质粒的天然防御系统。当外源基因入侵时，该防御系统的 CRISPR 序列会转录生成能与入侵基因组序列相识别的 RNA，介导 CRISPR 相关酶（Cas）在序列识别位点切割外源基因组 DNA，从而达到防御目的。

根据 Cas 蛋白的特点，CRISPR/Cas 基因剪刀分为三种类型，其中Ⅱ类最为简单，仅借助 Cas9 蛋白和 gRNA（guide RNA ）即可完成对靶目标的识别和剪切，准确性较高，操作容易，所以 CRISPR/Cas9 自从被发现以来，迅速成为了一种非常流行的基因编辑工具。

CRISPR/Cas9 发挥作用主要有三个步骤：首先，外源 DNA 部分序列插入到 CRISPR 序列的间隔区，随后，CRISPR 转录生成前体 crRNA，前体 crRNA 经过加工形成含有与外源基因匹配序列的 crRNA（ CRISPR-derived RNA ），该 crRNA 通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，最后，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。

通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA，改造成具有引导作用的 gRNA（guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 双链的定点切割（图 1）。

DNA 双链断裂后，细胞会经历两种 DNA 修复途径：非同源末端连接（NHEJ）途径和同源定向重（HDR）途径。没有模板的情况下，利用 NHEJ 修复，随机插入或缺失碱基造成基因失活；有模板存在的情况下，可通过同源重组（HDR）的方式在剪切位点引入目的修饰基因，实现基因的定点敲入和替换。

二、检验基因编辑的效果

为了确定引入的突变是否成功地插入或敲低了目标基因，必须对基因编辑进行检验。基因组 PCR 和基因测序是常用的检测手段，然而，检测蛋白的表达依然是检验基因敲除更有效的检测方式，因其可以避免来自结构内缺失 / 突变的信号。

在本文中，研究者使用 ATG5 Human Gene Knockout Kit（CRISPR）敲除 HEK293 细胞中自噬相关的 ATG5 蛋白，并插入绿色荧光蛋白（GFP）和抗嘌呤霉素基因。被转染细胞的GFP表达效率通过 SpectraMax i3x 酶标仪的成像功能（SpectraMax® MiniMax™ 300 细胞成像系统）来鉴定和计算（如图 2）, CRISPR 的敲除效果由 SpectraMax i3x 酶标仪的蛋白免疫印迹检测（ScanLater™ Western Blot 检测系统）来鉴定（图 3-图 4）。

CRISPER 基因编辑技术需要对整个过程进行细致的监控来确保编辑结果。SpectraMax i3x 多功能酶标仪为结果的分析提供了完整的解决方案。从最初的转染到蛋白敲除的确认。使用 MiniMax™ 300 细胞成像系统，研究人员可以通过比对未标记的细胞总数和表达荧光的转染细胞数评估转染效率。ScanLater 免疫印迹检测系统可以对非编辑细胞和 CRISPER 编辑的细胞中的目的蛋白进行灵敏检测和定量分析。

三、推荐仪器介绍

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